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实验笔记丨CRISPR-dCas9实验步骤详解

载体酶切 准备灭菌的PCR离心管，配制酶切体系，放置PCR仪，孵育3小时，终止酶切后使用1%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。琼脂糖凝胶DNA回收 将吸附柱置于收集管中，加入Buffer BL，离心活化硅胶膜；在紫外灯下，用刀片切下目的条带，尽量去除非目的DNA，确保体积最小。

sgRNA长度：SpCas9一般为20nt。 sgRNA序列碱基组成：基因特异的sgRNA模板序列位于PAM序列前，PAM序列特征为NGG （N为任意核苷酸），选择3末端含有GG的sgRNA，可构成PAM序列。sgRNA序列应避免以4个以上的T结尾，GC含量最佳为30%-70%（40%-60%）。

实验流程介绍 天然的CRISPR-Cas9系统由三部分组成：SpCas9 （简称Cas9）、crRNA、tracrRNA。tracrRNA（在CRISPR-Cas9编辑技术中被优化并命名为gRNA scaffold），它负责与Cas9结合，与重复序列具有同源性。crRNA为引导序列，约20个碱基，具有特异性。

前阵子才写道 ： CRISPR-Cas9基因敲除实验步骤 Month 4 --可能的收官之帖（但还远未结束） 说自己收官之作，哪里想到这么快就要继续开始新的实验了。

CRISPR/Cas9实验流程包括sgRNA设计，这一关键步骤确保实验的成功。设计原则主要聚焦于20nt靶点的II型CRISPR系统（如SpCas9），确保sgRNA序列的碱基组成（基因特异性模板序列前）遵循NGG（N为任意核苷酸）的PAM序列规则。避免sgRNA序列以4个以上的T结尾，同时保持GC%含量在30%-70%。

基本的HDR机制包括几个步骤： （1）DSB每侧的DNA在5 - 3个方向上被切除（DNA被解开，5个部分被切除），导致每个断端上有3个悬垂。（2）然后通过一种叫做RPA的蛋白稳定单链外挂，并与Rad51重组酶蛋白（每个形成核蛋白丝）结合。

如何把淘宝的黑号变白号了?

淘宝黑号变白的方法并不固定，因为淘宝的系统算法和规则随时在变化。但通常，要洗白一个淘宝黑号，用户需要改善自己在淘宝平台上的行为，提升信用度，并尝试与淘宝客服沟通解决问题。以下是一些建议性的步骤：首先，用户应该检查自己是否存在违规行为。

商家需要详细查看淘宝规定，找出可能触发黑号的违规行为，并进行整改。提供证明材料： 商家可以准备相关证明材料，如商品真实性证明、售后服务证明等，向淘宝客服提交，以证明自己的经营行为是合法的。与客服沟通： 主动与淘宝客服取得联系，说明整改情况，提供证明材料，并请客服协助尽快解封账号。

淘宝黑号转白号的方法其实挺简单的，就是不要参加或者违法活动，然后正常购物，一年之内就可以转白。淘宝黑号官方是没有具体规定的，如果想要恢复需要一系列操作，一般情况下黑号是无法进行恢复的。淘宝变成黑号后，无法领取优惠券，秒杀活动也无法参加，积分也会变得比较少。

淘宝号被黑了只要不继续参与刷单或者违规活动，正常的进行购物。这样一年左右就可以转白了，尤其是要大额订单的时候，使用黑号进行购买。详细操作：多用余额宝和花呗支付，对号有利。在有刚需大额订单的时候，用黑号下，正向消费额会增长号的信誉分。在天猫会员页面进行购物行为评价。

今年几月几号白露2023

年白露开始时间：9月8日05：26：31 2023年白露结束时间：9月23日14：49：46 2023年白露农历时间：七月廿四 2023年白露星期时间：周五 白露代表的寓意天气转凉 白露，是“二十四节气”中的第十五个节气，干支历申月的结束与酉月的起始。斗指癸，太阳达黄经165度，于公历9月7—9日交节。

年白露开始时间：9月8日 05：26：31 2023年白露结束时间：9月23日 14：49：46 2023年白露农历时间：七月廿四 2023年白露星期时间：周五 白露三候 一候：鸿雁来 鸟从北向南飞，大曰鸿，小曰雁。鸿雁是一种大型的水鸟，主要是在河流、湖畔等地方活动。每年到了9月初就要开始迁徙。

年白露时间：9月8日05：26：31，星期五，农历七月廿四。白露节气，大部分地区温度降低。白露是秋天的第三个节气，表示孟秋时节的结束和仲秋时节的开始。这时，人们就会明显地感觉到炎热的夏天已过，而凉爽的秋天已经到来了。

淘宝白黒号是什么意思?黑号有何影响?

1、淘宝白号就是注册出来之后没有买过东西的，也就是没有点数的号，一般买过东西之后得到卖家的好评之后就会有点数，那个时候就已经不是白号了，白嘛就是干干净净的那种，但是现在的意思有点不一样，好像只要不是1心的都叫做白号吧。黑号：所谓黑号，在淘宝官方并没有这一规则和定义。

2、淘宝白号是指淘宝账号的一种状态，即该账号没有任何违规记录，权重较高，可以享受淘宝平台的一些优惠政策和服务。淘宝白号与黑号相对，黑号通常是因为账号存在违规行为，如刷单、恶意评价、售假等行为，被淘宝平台标记并限制其部分功能或降低其权重。

3、淘宝白号：没有购买，没有信誉，没有实名。淘宝红号：一般指交易过多超出正常范围，超过20单。淘宝黑号：频繁参与虚假交易，信誉度高，被淘宝监控。

4、淘宝黑号就是：购买记录很异常，突然一个月暴涨了很多消费，而且购买的东西都是很混乱的，和小号标签根本匹配不起来，所以淘宝黑号就会被淘宝监控，数据异常，淘宝就会判定是虚假交易的。跟星级没有直接的关系的。淘宝小号分成黑号和白号。

5、淘宝白号就是没有购买、信誉、实名的账号。黑号就是频繁参与虚假交易、钻淘宝系统bug、退款、购买白菜单等等，导致被淘宝监控的账号。

6、淘宝黑号的影响淘宝黑号是指用户的淘宝账号受到限制，可能包括以下情况：冻结账号：用户可能会因涉嫌违规行为而被冻结账号，无法登录和进行购物。限制购物权限：即使账号未被冻结，用户仍可能受到限制，无法购买某些商品或执行特定操作。

京东白号怎么黑了

“如果发生京东账号领不了优惠券的情况，排除网络和京东系统正常的情况的话，大概率可能被黑号了。”小黑号已经开始进入京东黑名单了。主要表现形式为抢不到全品券，第三方辣鸡券输入验证码可以拿到。然后除了会员签到和京豆签到，任何地方得不到签到京豆。严重一点会导致抢购失败，就是秒杀全部不能下单。

和客服交涉被黑的 我被京东黑了两个账号，都是送来的书有破损，我去交涉，没换货赔了点钱了事。完全无拆单无拒收。

京东白号即安全账号，也就是京东账户没有出现违规的行为，状态一直正常。如果京东账户批量进行注册，这时注册的账户都是黑号，黑号在使用时某些功能会受到限制。所以，用户在平时要使用白号，不能使用黑号。

高中物理

高中物理是高中理科（自然科学）基础科目之一。该书是普通高中课程标准实验教科书。概念定义：物理学（physics）词源是希腊文physis即自然，也就是关于自然的科学。研究对象：物理学是一门重要的自然科学，它研究的是物质世界有关的问题。

一般来说是一学期两本书，必修共5本，高二第一学期第一学段（期中考试）上完。选修继续按号排，选修6-11。一般都只学到选修8（高二结束），重点校讲选修9。外国语类学校要学到选修11，但选9-11都是从头复习内容。

高中物理人教版共有2本必修，10本选修（分别是选修1-选修1-选修2-选修2-选修2-选修3-选修3-选修3-选修3-选修3-5）。

全国各地的高考卷子不同，所以高考物理的满分也不全相同，目前新课标理综全国卷中物理占110分，全国新课标理综物理部分组成为8道选择题48分（共8题，每题6分），2道实验题15分（22题6分，23题9分），2道计算题32分（24题12分，25题20分），选修部分15分。

高中物理有5本。高中物理版本：《高中物理》（人教版）：由人民教育出版社出版，是中国大陆常见的高中物理教材之一。《高中物理》（苏教版）：由江苏教育出版社出版，在江苏省等地使用较广泛。《高中物理》（北师大版）：由北京师范大学出版社出版，被一些学校或地区作为教材之一。